ştiri

În ultimul deceniu, tehnologia de secvențiere genică a fost utilizată pe scară largă în cercetarea cancerului și în practica clinică, devenind un instrument important pentru dezvăluirea caracteristicilor moleculare ale cancerului. Progresele în diagnosticul molecular și terapia țintită au promovat dezvoltarea conceptelor de terapie de precizie tumorală și au adus schimbări majore în întregul domeniu al diagnosticării și tratamentului tumoral. Testarea genetică poate fi utilizată pentru a avertiza asupra riscului de cancer, a ghida deciziile de tratament și a evalua prognosticul și reprezintă un instrument important pentru îmbunătățirea rezultatelor clinice ale pacienților. Aici, rezumăm articolele recente publicate în CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol și alte reviste pentru a analiza aplicarea testării genetice în diagnosticul și tratamentul cancerului.

Mutații somatice și mutații germinale. În general, cancerul este cauzat de mutații ale ADN-ului care pot fi moștenite de la părinți (mutații germinale) sau dobândite odată cu vârsta (mutații somatice). Mutațiile germinale sunt prezente de la naștere, iar mutatorul poartă de obicei mutația în ADN-ul fiecărei celule din organism și poate fi transmis descendenților. Mutațiile somatice sunt dobândite de indivizi în celule non-gametice și de obicei nu sunt transmise descendenților. Atât mutațiile germinale, cât și cele somatice pot distruge activitatea funcțională normală a celulelor și pot duce la transformarea malignă a acestora. Mutațiile somatice sunt un factor cheie al malignității și cel mai predictiv biomarker în oncologie; cu toate acestea, aproximativ 10 până la 20% dintre pacienții cu tumori poartă mutații germinale care le cresc semnificativ riscul de cancer, iar unele dintre aceste mutații sunt și terapeutice.
Mutația driver și mutația pasager. Nu toate variantele de ADN afectează funcția celulară; în medie, sunt necesare cinci până la zece evenimente genomice, cunoscute sub numele de „mutații driver”, pentru a declanșa degenerarea celulară normală. Mutațiile driver apar adesea în gene strâns legate de activitățile vitale celulare, cum ar fi genele implicate în reglarea creșterii celulare, repararea ADN-ului, controlul ciclului celular și alte procese vitale și au potențialul de a fi utilizate ca ținte terapeutice. Cu toate acestea, numărul total de mutații în orice cancer este destul de mare, variind de la câteva mii în unele tipuri de cancer de sân până la peste 100.000 în unele tipuri de cancer colorectal și endometrial extrem de variabile. Majoritatea mutațiilor nu au nicio semnificație biologică sau au o semnificație biologică limitată, chiar dacă mutația apare în regiunea codificatoare, astfel de evenimente mutaționale nesemnificative fiind numite „mutații pasager”. Dacă o variantă genetică dintr-un anumit tip de tumoră prezice răspunsul sau rezistența sa la tratament, varianta este considerată operabilă clinic.
Oncogene și gene supresoare tumorale. Genele care sunt frecvent mutate în cancer pot fi împărțite aproximativ în două categorii, oncogene și gene supresoare tumorale. În celulele normale, proteina codificată de oncogene joacă în principal rolul de a promova proliferarea celulară și de a inhiba apoptoza celulară, în timp ce proteina codificată de genele oncosupresoare este responsabilă în principal pentru reglarea negativă a diviziunii celulare pentru a menține funcția celulară normală. În procesul de transformare malignă, mutația genomică duce la creșterea activității oncogene și la scăderea sau pierderea activității genelor oncosupresoare.
Variații mici și variații structurale. Acestea sunt cele două tipuri principale de mutații din genom. Variantele mici modifică ADN-ul prin modificarea, ștergerea sau adăugarea unui număr mic de baze, inclusiv inserția de baze, ștergerea, schimbarea cadrului de citire, pierderea codonilor de început, mutațiile de pierdere a codonilor de oprire etc. Variația structurală este o rearanjare genomică amplă, care implică segmente genetice cu dimensiuni variabile de la câteva mii de baze până la majoritatea cromozomului, inclusiv modificări ale numărului de copii ale genelor, ștergerea cromozomilor, duplicarea, inversiunea sau translocația. Aceste mutații pot provoca o reducere sau o amplificare a funcției proteinelor. Pe lângă modificările la nivelul genelor individuale, semnăturile genomice fac parte și din rapoartele de secvențiere clinică. Semnăturile genomice pot fi văzute ca modele complexe de variații mici și/sau structurale, inclusiv încărcătura mutațională tumorală (TMB), instabilitatea microsateliților (MSI) și defectele de recombinare omoloagă.

Mutație clonală și mutație subclonală. Mutațiile clonale sunt prezente în toate celulele tumorale, sunt prezente la momentul diagnosticului și rămân prezente după avansarea tratamentului. Prin urmare, mutațiile clonale au potențialul de a fi utilizate ca ținte terapeutice tumorale. Mutațiile subclonale sunt prezente doar într-un subset de celule canceroase și pot fi detectate la începutul diagnosticului, dar dispar odată cu recurența ulterioară sau apar numai după tratament. Heterogenitatea cancerului se referă la prezența mai multor mutații subclonale într-un singur cancer. În special, marea majoritate a mutațiilor driver semnificative clinic la toate speciile comune de cancer sunt mutații clonale și rămân stabile pe tot parcursul progresiei cancerului. Rezistența, care este adesea mediată de subclone, poate să nu fie detectată la momentul diagnosticului, dar apare atunci când acesta recidivează după tratament.

Tehnica tradițională FISH sau cariotipul celular este utilizată pentru a detecta modificările la nivel cromozomial. FISH poate fi utilizat pentru a detecta fuziuni, deleții și amplificări genetice și este considerat „standardul de aur” pentru detectarea unor astfel de variante, cu o precizie și o sensibilitate ridicate, dar cu un randament limitat. În unele malignități hematologice, în special leucemia acută, cariotiparea este încă utilizată pentru a ghida diagnosticul și prognosticul, dar această tehnică este înlocuită treptat de teste moleculare țintite, cum ar fi FISH, WGS și NGS.
Modificările genelor individuale pot fi detectate prin PCR, atât prin PCR în timp real, cât și prin PCR digitală cu picături. Aceste tehnici au o sensibilitate ridicată, sunt deosebit de potrivite pentru detectarea și monitorizarea leziunilor reziduale mici și pot obține rezultate într-un timp relativ scurt, dezavantajul fiind că intervalul de detecție este limitat (de obicei, detectează doar mutații la una sau câteva gene), iar capacitatea de a efectua teste multiple este limitată.
Imunohistochimia (IHC) este un instrument de monitorizare bazat pe proteine, utilizat în mod obișnuit pentru a detecta expresia biomarkerilor precum ERBB2 (HER2) și receptorii de estrogen. IHC poate fi utilizată și pentru a detecta proteine ​​mutate specifice (cum ar fi BRAF V600E) și fuziuni genetice specifice (cum ar fi fuziunile ALK). Avantajul IHC este că poate fi integrată cu ușurință în procesul de analiză de rutină a țesuturilor, astfel încât poate fi combinată cu alte teste. În plus, IHC poate oferi informații despre localizarea proteinelor subcelulare. Dezavantajele sunt scalabilitatea limitată și cerințele organizaționale ridicate.
Secvențierea de a doua generație (NGS) NGS utilizează tehnici de secvențiere paralelă de mare randament pentru a detecta variații la nivel de ADN și/sau ARN. Această tehnică poate fi utilizată pentru a secvenția atât întregul genom (WGS), cât și regiunile genetice de interes. WGS oferă cele mai cuprinzătoare informații despre mutațiile genomice, dar există numeroase obstacole în calea aplicării sale clinice, inclusiv necesitatea unor probe proaspete de țesut tumoral (WGS nu este încă potrivit pentru analiza probelor imobilizate în formalină) și costul ridicat.
Secvențierea NGS țintită include secvențierea întregului exon și un panel de gene țintă. Aceste teste îmbogățesc regiunile de interes prin sonde ADN sau amplificare PCR, limitând astfel cantitatea de secvențiere necesară (întregul exom reprezintă 1 până la 2% din genom, iar chiar și panelurile mari care conțin 500 de gene reprezintă doar 0,1% din genom). Deși secvențierea întregului exon are performanțe bune în țesuturile fixate cu formalină, costul său rămâne ridicat. Combinațiile de gene țintă sunt relativ economice și permit flexibilitate în selectarea genelor care urmează să fie testate. În plus, ADN-ul liber circulant (cfDNA) apare ca o nouă opțiune pentru analiza genomică a pacienților cu cancer, cunoscută sub numele de biopsii lichide. Atât celulele canceroase, cât și celulele normale pot elibera ADN în fluxul sanguin, iar ADN-ul eliberat de celulele canceroase se numește ADN tumoral circulant (ctDNA), care poate fi analizat pentru a detecta potențiale mutații în celulele tumorale.
Alegerea testului depinde de problema clinică specifică care trebuie abordată. Majoritatea biomarkerilor asociați cu terapiile aprobate pot fi detectați prin tehnici FISH, IHC și PCR. Aceste metode sunt rezonabile pentru detectarea unor cantități mici de biomarkeri, dar nu îmbunătățesc eficiența detectării odată cu creșterea randamentului, iar dacă se detectează prea mulți biomarkeri, este posibil să nu existe suficient țesut pentru detectare. În unele tipuri de cancer specifice, cum ar fi cancerul pulmonar, unde probele de țesut sunt dificil de obținut și există mai mulți biomarkeri de testat, utilizarea NGS este o alegere mai bună. În concluzie, alegerea testului depinde de numărul de biomarkeri care trebuie testați pentru fiecare pacient și de numărul de pacienți care trebuie testați pentru biomarker. În unele cazuri, utilizarea IHC/FISH este suficientă, în special atunci când ținta a fost identificată, cum ar fi detectarea receptorilor de estrogen, a receptorilor de progesteron și a ERBB2 la pacientele cu cancer mamar. Dacă este necesară o explorare mai cuprinzătoare a mutațiilor genomice și căutarea potențialelor ținte terapeutice, NGS este mai organizată și mai rentabilă. În plus, NGS poate fi luată în considerare în cazurile în care rezultatele IHC/FISH sunt ambigue sau neconcludente.

Diverse ghiduri oferă îndrumări cu privire la pacienții eligibili pentru testarea genetică. În 2020, Grupul de lucru ESMO pentru medicină de precizie a emis primele recomandări de testare NGS pentru pacienții cu cancer avansat, recomandând testarea NGS de rutină pentru cancerul pulmonar non-scuamos avansat, non-microcelular, cancerul de prostată, cancerul colorectal, cancerul de canal biliar și probele tumorale de cancer ovarian, iar în 2024, ESMO a actualizat pe această bază, recomandând includerea cancerului de sân și a tumorilor rare, cum ar fi tumorile stromale gastrointestinale, sarcoamele, cancerele tiroidiene și cancerele de origine necunoscută.
În 2022, Opinia Clinică ASCO privind testarea genomului somatic la pacienții cu cancer metastatic sau avansat afirmă că, dacă o terapie legată de biomarkeri este aprobată la pacienții cu tumori solide metastatice sau avansate, se recomandă testarea genetică pentru acești pacienți. De exemplu, testarea genomică ar trebui efectuată la pacienții cu melanom metastatic pentru a depista mutațiile BRAF V600E, deoarece inhibitorii RAF și MEK sunt aprobați pentru această indicație. În plus, testarea genetică ar trebui efectuată și dacă există un marker clar de rezistență pentru medicamentul care urmează să fie administrat pacientului. Egfrmab, de exemplu, este ineficient în cancerul colorectal cu mutație KRAS. Atunci când se ia în considerare adecvarea unui pacient pentru secvențierea genelor, trebuie integrate starea fizică a pacientului, comorbiditățile și stadiul tumorii, deoarece seria de etape necesare pentru secvențierea genomului, inclusiv consimțământul pacientului, procesarea în laborator și analiza rezultatelor secvențierii, impun ca pacientul să aibă o capacitate fizică și o speranță de viață adecvate.
Pe lângă mutațiile somatice, unele tipuri de cancer ar trebui testate și pentru genele germinale. Testarea pentru mutațiile germinale poate influența deciziile de tratament pentru cancere precum mutațiile BRCA1 și BRCA2 în cancerele de sân, ovarian, de prostată și pancreatic. Mutațiile germinale pot avea, de asemenea, implicații pentru screening-ul și prevenirea viitoare a cancerului la pacienți. Pacienții care sunt potențial potriviți pentru testarea pentru mutații germinale trebuie să îndeplinească anumite condiții, care implică factori precum antecedentele familiale de cancer, vârsta la momentul diagnosticării și tipul de cancer. Cu toate acestea, mulți pacienți (până la 50%) care poartă mutații patogene în linia germinală nu îndeplinesc criteriile tradiționale pentru testarea mutațiilor germinale pe baza antecedentelor familiale. Prin urmare, pentru a maximiza identificarea purtătorilor de mutații, Rețeaua Națională Cuprinzătoare de Cancer (NCCN) recomandă ca toți sau majoritatea pacienților cu cancer de sân, ovarian, endometrial, pancreatic, colorectal sau de prostată să fie testați pentru mutații germinale.
În ceea ce privește momentul efectuării testelor genetice, deoarece marea majoritate a mutațiilor driver semnificative clinic sunt clonale și relativ stabile pe parcursul progresiei cancerului, este rezonabil să se efectueze teste genetice la pacienți în momentul diagnosticării cancerului avansat. Pentru testele genetice ulterioare, în special după terapia moleculară țintită, testarea ADNct este mai avantajoasă decât ADN-ul țesutului tumoral, deoarece ADN-ul sanguin poate conține ADN din toate leziunile tumorale, ceea ce este mai propice obținerii de informații despre heterogenitatea tumorii.
Analiza ADNct după tratament poate fi capabilă să prezică răspunsul tumorii la tratament și să identifice progresia bolii mai devreme decât metodele imagistice standard. Cu toate acestea, nu au fost stabilite protocoale pentru utilizarea acestor date pentru a ghida deciziile privind tratamentul, iar analiza ADNct nu este recomandată decât în ​​studiile clinice. ADNct poate fi, de asemenea, utilizat pentru a evalua leziunile reziduale mici după intervenția chirurgicală radicală a tumorii. Testarea ADNct după intervenția chirurgicală este un predictor puternic al progresiei ulterioare a bolii și poate ajuta la determinarea dacă un pacient va beneficia de chimioterapie adjuvantă, dar totuși nu se recomandă utilizarea ADNct în afara studiilor clinice pentru a ghida deciziile privind chimioterapia adjuvantă.

Prelucrarea datelor Primul pas în secvențierea genomului este extragerea ADN-ului din probele pacienților, pregătirea bibliotecilor și generarea datelor brute de secvențiere. Datele brute necesită o procesare suplimentară, inclusiv filtrarea datelor de calitate scăzută, compararea acestora cu genomul de referință, identificarea diferitelor tipuri de mutații prin diferiți algoritmi analitici, determinarea efectului acestor mutații asupra traducerii proteinelor și filtrarea mutațiilor liniei germinale.
Adnotarea genei driver este concepută pentru a distinge mutațiile driverului de cele ale pasagerului. Mutațiile driverului duc la pierderea sau amplificarea activității genelor supresoare tumorale. Variantele mici care duc la inactivarea genelor supresoare tumorale includ mutații nonsens, mutații frameshift și mutații cheie ale situsului de splicing, precum și deleții mai puțin frecvente ale codonului de start, deleții ale codonului stop și o gamă largă de mutații de inserție/deleție a intronilor. În plus, mutațiile missense și mutațiile mici de inserție/deleție a intronilor pot duce, de asemenea, la pierderea activității genelor supresoare tumorale atunci când afectează domenii funcționale importante. Variantele structurale care duc la pierderea activității genelor supresoare tumorale includ deleția parțială sau completă a genelor și alte variante genomice care duc la distrugerea cadrului de citire a genei. Variantele mici care duc la o funcție amplificată a oncogenelor includ mutații missense și inserții/deleții ocazionale de introni care vizează domenii funcționale importante ale proteinelor. În cazuri rare, trunchierea proteinelor sau mutațiile situsului de splicing pot duce la activarea oncogenelor. Variațiile structurale care duc la activarea oncogenelor includ fuziunea genelor, deleția genelor și duplicarea genelor.
Interpretarea clinică a variației genomice evaluează semnificația clinică a mutațiilor identificate, adică valoarea lor potențială diagnostică, prognostică sau terapeutică. Există mai multe sisteme de clasificare bazate pe dovezi care pot fi utilizate pentru a ghida interpretarea clinică a variației genomice.
Baza de date Oncologică de Medicină de Precizie (OncoKB) a Centrului de Cancer Memorial Sloan-Kettering clasifică variantele genetice în patru niveluri, pe baza valorii lor predictive pentru utilizarea medicamentelor: Nivelul 1/2, biomarkeri aprobați de FDA sau standard clinic, care prezic răspunsul unei indicații specifice la un medicament aprobat; Nivelul 3, biomarkeri aprobați sau neaprobați de FDA, care prezic răspunsul la medicamente noi țintite care s-au dovedit promițătoare în studiile clinice și Nivelul 4, biomarkeri neaprobați de FDA, care prezic răspunsul la medicamente noi țintite care au demonstrat dovezi biologice convingătoare în studiile clinice. A fost adăugat un al cincilea subgrup asociat cu rezistența la tratament.
Ghidurile Societății Americane de Patologie Moleculară (AMP)/Societății Americane de Oncologie Clinică (ASCO)/Colegiului Patologilor Americani (CAP) pentru interpretarea variației somatice împart variația somatică în patru categorii: Gradul I, cu semnificație clinică puternică; Gradul II, cu semnificație clinică potențială; Gradul III, semnificație clinică necunoscută; Gradul IV, nu se cunoaște semnificația clinică. Doar variantele de gradul I și II sunt valoroase pentru deciziile de tratament.
Scala ESCAT (Molecular Target Clinical Operability Scale) a ESMO clasifică variantele genetice în șase niveluri: Nivelul I, ținte potrivite pentru utilizarea de rutină; Faza II, o țintă care este încă în curs de studiu, este probabil utilizată pentru a examina populația de pacienți care ar putea beneficia de medicamentul țintă, dar sunt necesare mai multe date pentru a susține această afirmație. Gradul III, variante genetice țintă care au demonstrat beneficii clinice și la alte specii de cancer; Gradul IV, doar variante genetice țintă susținute de dovezi preclinice; În gradul V, există dovezi care susțin semnificația clinică a țintirii mutației, dar terapia cu un singur medicament împotriva țintei nu prelungește supraviețuirea sau se poate adopta o strategie de tratament combinată; Gradul X, lipsă de valoare clinică.